THESPRINGEQUINOX

　　二、N-氨甲酰谷氨酸研究进展

　　1.精氨酸

　　精氨酸（Arginine），化学式为C6H14N4O2，分子量为174.2，是氨基酸类化合物。白色菱形结晶（从水中析出，含2分子结晶水）或单斜片状结晶（无结晶水），无臭，味苦；易溶于水（0℃水中溶解度为83g/L，50℃水中溶解度为400g/L），微溶于乙醇，不溶于乙醚。CAS（国化学文摘服务社）编号：L-精氨酸（CAS：74-79-3），D-精氨酸（CAS：157-06-2），DL-精氨酸（CAS：7200-25-1）。

　　精氨酸可作为多种化合物的前体，包括一氧化氮、肌酸、尿素、多胺、脯氨酸、谷氨酸和胍基丁胺等。精氨酸参与多种代谢过程，对动物机体有多种有益作用，可促进血管生成、乳生成，促进氮代谢、生殖、泌乳、免疫和生长等过程。在广泛的生理和病理生理条件下发挥重要作用，因此受到广泛关注。

　　虽然精氨酸作为尿素循环的中间产物和肌酸生物合成的前体一直为生化学家所熟知。然而直到研究表明精氨酸是一氧化氮生物合成中氮原子的来源，人们才开始对他有了进一步研究的兴趣。众所周知，反刍动物需要从饲料中获得必需氨基酸和非必需氨基酸，以满足自身生长发育和维持生产。精氨酸代谢是尿素循环的重要组成部分，也是尿素合成和氨解毒的主要途径。在氨甲酰磷酸合成酶（carbamylphosphatesynthetase-I，CPS-I）的作用下，肝细胞和肠道细胞利用氨和二氧化碳在线粒体中合成尿素。精氨酸不仅是尿素循环的中间产物，也是合成尿素、一氧化氮（NO）和多胺类物质的前体，同时还调节着对反刍动物的健康、生长和繁殖的关键代谢途径。尽管反刍动物可以合成内源性精氨酸，但在生长发育的早期阶段和高产时期，内源合成的精氨酸不足以满足生长发育和维持生产水平。添加精氨酸可以通过有效调控尿素循环来降低血浆氨负荷，从而提高高产动物的生产性能和氮的利用率。

　　之前的研究表明，静脉灌注精氨酸可以改善犊牛的氮代谢，提高泌乳奶牛的产奶量。多产母羊注射 精氨酸能提高羔羊出生体重，提高满月羔羊成活率。随着集约化程度的越来越高，为了提高经济效益，高产奶牛日粮中的蛋白含量往往很高，这不但增加了血氨浓度，影响奶牛繁殖性能和泌乳性能，降低氮的利用率，还增加了粪便和尿液中的氮排放，造成环境污染。因此，通过精氨酸对尿素循环的有效调控，降低血氨浓度，能够提高高产奶牛的生产性能，提高氮的利用率。然而精氨酸的瘤胃降解率很高，无法过瘤胃到达肠道发挥生物学功能。然而通过颈静脉灌注精氨酸的方法，虽然能够确保精氨酸发挥生物学功能，提高反刍动物生产性能，但在现代牧场中难以实际应用。而饲喂瘤胃保护精氨酸也大大增加了饲养成本，降低了牧场在养殖业中的竞争力。

　　2.N-氨甲酰谷氨酸

　　NCG是N-Carbamylglutamate的简称，中文名称为：N-氨甲酰谷氨酸。其分子式为C6H10N2O5，分子量是190.2，纯品为无色透明晶体，CAS（国化学文摘服务社）编号为1188-38-1。NCG不溶于水，微溶于有机溶剂，活性物质等电点为3.02，其盐类溶于水。

　　图2N-乙酰谷氨酸和N-氨甲酰谷氨酸结构

　　N-氨甲酰谷氨酸是N-乙酰谷氨酸（N-acetylglutamate，NAG）的结构类似物，不同的是，NAG在体内易于水解，而NCG基于其理化性质，在体内外均相对稳定，且不易被酰化氨基酸水解酶降解。众所周知，氨基甲酰磷酸合成酶（carbamylphosphatesynthetaseI，CPS-I）是鸟氨酸循环中的限速酶，当它不活跃时，鸟氨酸的循环效率会大大降低。而NCG可以通过线粒体膜进入线粒体内部，通过促进CPS-I的活化来促进尿素循环，促进内源性精氨酸、多胺和一氧化氮的合成。一方面改善动物对氮的利用率提高生产性能，另一方面也能增加一氧化氮浓度，降低血氨浓度，提高机体抗氧化能力，促进动物机体的健康。基于不同的理化性质，NCG在瘤胃中降解率降低，研究表明L-精氨酸和NCG在瘤胃液中24h的降解率分别为100%和17.8%，与对照组相比，添加NCG和精氨酸的显著提高了体外产气量和乙酸丙酸比，降低了微生物蛋白质量。精氨酸在瘤胃的快速降解是一个营养浪费的过程，而NCG可以在不经过包被处理的情况下添加到反刍动物的日粮中。

　　相比于精氨酸，在反刍动物生产中应用NCG还有以下好处：

　　（1）NCG的价格也要低于精氨酸。

　　（2）相比精氨酸，NCG不会抑制日粮中的碱性氨基酸在肠道的吸收。

　　（3）NCG能够持续激活肠道瓜氨酸的合成，促进哺乳期间精氨酸的平衡。

　　因此，NCG是提高血浆精氨酸浓度和提高反刍动物生产性能的潜在饲料添加剂。

　　图3尿素循环以及精氨酸合成的相关途径

　　3.N-氨甲酰谷氨酸在动物生产中的应用

　　在饲料中，氮是构建蛋白质的基本单元。蛋白质是反刍动物日粮中昂贵和必需的部分。因此，在饲养过程中理解氮的使用对于提高养殖利润、降低对环境产生的影响是特别重要的。对于反刍动物来说，小肠可利用的氨基酸是保证组织的生长和发育的重要营养物质。反刍动物氮营养素的利用基本上包括两个方面。一方面是为瘤胃提供充足的氮和碳水化合物，保证瘤胃微生物的生长和微生物蛋白的合成，第二方面是通过小肠吸收氨基酸合成蛋白质以满足机体的需要。

　　NCG作为动物机体内源精氨酸的促进剂，能够促进机体氮代谢、生长、泌乳、繁殖和免疫等过程。提高反刍动物氮利用率意味着提高反刍动物重新利用氮的能力，这些氮主要是有毒的氨，并且来源于蛋白合成的副产物。在粪中被排放的氮是由未消化的饲料、微生物蛋白和内源性的其他来源，而在尿中被排放的氮主要来自于瘤胃内的氮损失，这种损失是由于瘤胃内大量蛋白质降解所导致的。通过降低日粮中氮浓度，或者通过微生物蛋白合成保证瘤胃内被降解氮的利用率提高，减少瘤胃氮损失，是两种可能的方法。血液中的尿素进入瘤胃经过两条途径：1）沿浓度梯度简单扩散；2）由尿素转运-B蛋白（Ureatransporter-B，UT-B）作为载体调节支配的扩散。进入瘤胃的尿素很快被水解为氨和二氧化碳；氨态氮可作为微生物蛋白合成的氮源，同时超过微生物利用能力的氨可被门静脉吸收在肝脏中脱毒后循环利用。在上皮细胞中质子可以与尿素转运蛋白形成氢键，导致结构发生变化，由此激活载体调节过程将尿素转运入瘤胃。因此，内脏中尿素的合成降低了反刍动物血液中氨的含量，进而提高了氮的利用率。而尿素可以在瘤胃微生物脲酶作用下降解为氨，故氮素又可以以氨的形式被用于微生物蛋白的合成。以氨的形式进行的氮的再利用以及尿素的转运为菌体蛋白的合成提供了氮源。一般情况下，大约有29%～99%的总肝脏排出的尿素氮在胃肠道进行重利用，在胃肠道中被利用的尿素氮约有16%～70%可以被用于同化代谢，3%～21%在粪中被损失掉，17%-80%回到尿素循环中被重新合成尿素。因此，游离尿素氮的重新利用为提高反刍动物充分利用日粮中的氮提供了氮来源。

　　健康的初生仔猪、犊牛、羔羊是养殖企业盈利的基础。不幸的是，目前为止初生动物的死亡率仍然是世界范围内的一个重大问题。在高纬度地区的冬季，初生动物的体温损失严重，当牲畜暴露在寒冷环境中，身体储备的营养物质将被分解产生热量来保持体温。研究表明，绵羊在妊娠中期的胎儿会产生褐色的脂肪组织储备。内源性合成精氨酸对维持新生猪和断奶仔猪精氨酸稳态具有重要作用。而精氨酸还能降低母体的脂肪沉积，促进胎儿器官和组织的发育以及胎儿棕色脂肪组织的产生。

　　因此，在冬季妊娠期，日粮中添加NCG可能是提高动物妊娠期血浆精氨酸浓度的途径，可维持新生儿体内环境稳定，防止新生儿死亡，从而提高动物的生产能力和盈利能力。断奶的仔猪、犊牛饲养中极易发生氧化应激，特别是腹泻。日粮中添加NCG可以促进断奶猪肠道生长，提高热休克蛋白mRNA丰度，预防肠道功能障碍，改善断奶应激，提高生长性能。此外，精氨酸的氮含量十分丰富，对幼龄哺乳动物的生长发育起着重要作用。研究表明，口服补饲NCG能够提高小鼠血浆精氨酸和生长激素的浓度，促进小鼠的生长发育，还能提高育成猪肌肉蛋白的合成。添加NCG还能增加断奶仔猪肠黏膜增殖细胞核抗原mRNA的表达量，诱导肠黏膜细胞生长和增殖，改善肠黏膜形态。

　　由此可见，断奶期动物饲喂NCG可降低氧化应激水平，提高机体免疫力和生长性能，从而提高动物生产能力和盈利能力。

　　乳腺在必要时可以有效地获取氨基酸。日粮中缺乏单一的必需氨基酸会导致在乳腺中这种氨基酸的转运活动提高43倍，从而使得通过血液到达乳腺的这种单一的氨基酸提高33%。当从血液中去除掉某种氨基酸后，乳腺的反应会增加，这也导致其他组织对于这种氨基酸的重新利用程度降低从而提高乳腺的利用率。因此，增加乳腺可获得营养物质的数量对于提高乳中氨基酸的吸收是至关重要的。N-氨甲酰谷氨酸作为精氨酸的促进剂可以调节尿素循环和可吸收氨基酸的平衡，这些氨基酸可以被乳腺用来合成乳蛋白。很多研究表明，精氨酸能够提高奶牛的产奶量和生长激素的水平。然而高产奶牛需要饲喂高蛋白日粮以期达到高产奶量的水平，从而容易导致氨中毒，降低采食量。

　　现代的集约化饲养模式使得奶牛排卵期变长，无发情期，黄体期异常，激素的使用使机体内分泌紊乱，胚胎损失较大。研究表明泌乳前期奶牛血浆中的尿素氮和氨的含量都维持在较高水平，同时排卵前的卵泡液和黄体期的子宫液中的氮含量升高。这是由于饲喂高产奶牛的日粮蛋白质水平较高，血浆的尿素氮水平较高，而氨和尿素氮等含氮物质对胚胎有消极影响，降低了其繁殖能力。日粮中添加NCG可以通过促进内源精氨酸的合成提高血浆中精氨酸的浓度。研究表明添加NCG能够显著降低人和仔猪血浆中的氨的含量，促进尿素的再循环。与此同时，NCG还能提高血浆中一氧化氮的浓度，一氧化氮能够清除自由基，提高机体抗氧化能力。研究表明，添加NCG能够提高羔羊抗氧化能力和血浆中总超氧化物歧化酶的浓度。断奶仔猪的日粮中添加NCG还能促进其小肠绒毛的发育提高生长性能，大大降低了断奶应激带来的腹泻等疾病，提高经济效益。

　　因此，NCG不仅能够增强机体免疫和抗氧化能力，还能提高动物受胎率，为大力发展健康养殖提供了新思路。

　　THESPRINGEQUINOX

　　三、肠道氨基酸转运载体

　　肠道是动物对营养物质的消化吸收的主要场所。其中大部分蛋白质水解成的氨基酸会被小肠绒毛的上皮细胞所吸收。氨基酸的种类很多，参与蛋白质合成的主要有20种左右。日粮中氨基酸和肽的吸收过程就是肠道氨基酸和肽的特异性转运载体识别运输的过程。氨基酸转运载体是一种利用细胞中的三磷酸腺苷（ATP）将氨基酸从细胞外转运到细胞内的重要蛋白质，同时还能作为信号分子作用于有关氨基酸代谢的信号通路，调控氨基酸的代谢活动，对机体的生长发育有着重要作用。根据在氨基酸的转运过程中是否有钠离子参与分为钠离子依赖性氨基酸转运载体和钠离子非依赖性氨基酸转运载体。其中钠离子非依赖性氨基酸转运载体是通过钾离子的外流进行氨基酸的转运。基于氨基酸不同的生理功能，氨基酸的转运载体也分为酸性、碱性和中性氨基酸转运载体。酸性氨基酸主要以谷氨酸和天门冬氨酸为主，SLC1A1作为特异性酸性氨基酸转运载体，是可溶性载体家族中的1成员1；碱性氨基酸的转运载体（SLC7A7和SLC7A9）主要负责特异性地转运赖氨酸、精氨酸、组氨酸、亮氨酸和异亮氨酸等碱性氨基酸；中性氨基酸转运载体（SLC1A5和SLC619）主要负责的是丙氨酸、丝氨酸和半胱氨酸的转运。作为氨基酸转运载体的功能是多元特异性的，即能够特异性地转运多种氨基酸。在转运氨基酸的时候可以将氨基酸顺浓度梯度地从细胞膜外运输到细胞内，也能通过钠离子、钾离子、氢离子和氢氧根离子的偶联作用，将氨基酸逆浓度梯度的从细胞膜外运输到细胞内。研究表明，血浆中的生长激素水平能够提高肠道氨基酸转运载体mRNA的表达，促进肠道对各种氨基酸的吸收。然而目前人们对氨基酸转运载体运输氨基酸过程的转运机制的研究还不是很清楚。

　　动物对饲料中营养物质消化吸收的过程中，都伴随着肠道细胞对各种营养素的转运。同时在它们之间也建立相应的化学感应机制。营养物质会通过与细胞膜上的受体结合而造成细胞膜的电位及生理特性的改变，这种变化会被通过信号传递给细胞中导致多种功能性蛋白质的表达发生改变，进而调控着机体的相关信号通路。其中常见的感应机制就是氨基酸转运载体能特异性的感受到细胞膜两侧的某种氨基酸的浓度变化，并且通过改变自身结构的方式使细胞膜的生理特性发生改变来传递信号。此外氨基酸转运载体还能通过特异性感知细胞膜外氨基酸的可利用性来传递信号，进而影响局部氨基酸的浓度。许多研究表明，结构域蛋白、热休克蛋白、营养物质转运载体蛋白等都通过相互作用或者改变自身的结构来参与细胞中各种信号的传递。因此蛋白质之间的相互作用对细胞中各种信号的调控是密不可分的。

　　THESPRINGEQUINOX

　　四、动物体内蛋白合成信号通路

　　1.哺乳动物雷帕霉素靶蛋白的蛋白合成信号通路

　　哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammaliantargetofrapamycin，mTOR）有2549个氨基酸构成，在mTOR的氨基端有两个分别为亲水和疏水的α螺旋组成的重复序列，这个序列能够通过介导各种蛋白质和mTOR之间的相互作用来发挥功能，在mTOR的羧基端是功能性部分，主要由激酶组成，来抑制雷帕霉素对它的影响。mTOR蛋白合成信号通路具有调控蛋白合成的功能，它是一种参与机体信号调控的蛋白激酶，在细胞的增殖分化和动物的生长发育上发挥了重要作用。哺乳动物雷帕霉素靶蛋白通过mTORC1和mTORC2组成的mTOR复合物发挥作用。研究发现，mTORC1复合物受到精氨酸和亮氨酸的调控，使其聚集到溶酶体表面，激活相关蛋白的表达，促进动物所需蛋白质的合成。

　　2.生长因子对mTOR通路的调控

　　生长激素是由垂体分泌的一种肽类激素，它在mTOR的表达过程中起着调控作用。促生长因子（IGF-1）能够作为上游信号分子通过激活磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）将信号传递给mTOR，进而激活mTOR的表达。研究表明，当肌肉的卫星细胞受到IGF-1的刺激后，mTOR的表达水平显著提高，促进细胞与生长相关基因的转录和翻译。生长因子水平和氨基酸浓度都能激活mTOR的信号传递。

　　3.氨基酸对mTOR通路的调控

　　随着国内外学者对动物营养的研究日益深入，关于蛋白质的研究也越来越多，然而想要充分了解蛋白质的活性、结构以及蛋白质之间的相互作用，就必须深入了解氨基酸代谢的机制与特性。氨基酸不仅能够合成蛋白质，还能通过调控mTOR信号通路来调节机体的各项生理功能。研究表明，雷帕霉素能够缓解经氨基酸处理的肝细胞中自噬蛋白的降解情况。初生仔猪的日粮中添加精氨酸，能够提高mTOR的表达，促进骨骼肌中蛋白质的合成。mTOR在细胞中发挥功能需要进行活化成磷酸化的哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（Phosphorylationmammaliantargetofrapamycin，p-mTOR）。有研究发现，动物细胞中的胞内蛋白可以调控mTOR复合物的信号通路，提高p-mTOR的表达水平，进而促进机体蛋白质的合成。p-mTOR水平也侧面反映了氨基酸对mTOR的调控程度。然而激活mTOR的上游到底是某些功能性氨基酸还是其他途径仍然存在争议，因此，氨基酸调控mTOR信号通路的分子机制还有待于进一步研究。

　　THESPRINGEQUINOX

　　五、本研究的目的和意义

　　出于对经济和环境的考虑，人们对降低反刍动物氮排放的同时提高生产性能产生了浓厚的兴趣。在国内优质蛋白饲料短缺的情况下，提高饲料中氮营养素的利用成为了突破养殖业瓶颈的关键因素。为了提高牧场在经济全球化背景下的市场竞争力，同时也适应我国畜牧业高速发展，集约化程度越来越高带来的，人们对畜产品质量要求越来越高的现状。因此，亟需寻找和开发一种安全、有效的饲料添加剂来提高反刍动物对氮营养素的利用。

　　本试验通过探究日粮中添加不同剂量NCG对荷斯坦公牛生长性能、营养物质消化率、瘤胃发酵、氮代谢及血液生化指标的影响，确定了NCG应用于肉牛生产中的合适添加剂量；探究以尿素为氮源的日粮中添加NCG对荷斯坦公牛生长性能、营养物质消化率、氮排放、屠宰性能及收益的影响，揭示了NCG对饲喂尿素日粮的荷斯坦公牛对非蛋白氮利用率的影响，同时也研究了不同氮源日粮和日粮中添加NCG之间是否存在组合效应的问题；从分子水平探讨以尿素为氮源的日粮中添加NCG对荷斯坦公牛肠道养分吸收和参与蛋白合成的信号通路中关键蛋白表达的影响，初步阐明了NCG对肉牛氮营养素利用的调控作用。旨在探究NCG对肉牛氮营养素利用的影响，为提高肉牛对氮营养素利用和减少氮排放提供技术参考，为不同氮源日粮中添加NCG在肉牛上的应用提供了理论依据。

　　THESPRINGEQUINOX

　　六、本研究的主要内容和技术路线

　　1、研究的主要内容

　　本试验在以下三部分进行研究：

　　（1）日粮中添加不同剂量的NCG对荷斯坦公牛生长性能、表观消化率、氮代谢、瘤胃发酵和血液生化指标的影响

　　（2）尿素日粮中添加NCG对荷斯坦公牛生长性能、表观消化率、氮代谢、血液生化指标、瘤胃发酵、微生物多样性和经济效益的影响

　　（3）尿素日粮中添加NCG对荷斯坦公牛屠宰性能、肉品质、肠道养分吸收和mTOR信号通路表达的影响

　　2、技术路线

　　图4本试验的技术路线图

　　———该文章来源于作者：杨金山博士